Analýza verejných údajov
Údaje o líniách SARS-CoV-2 a dátum odobratia vzorky zo sekvencií dostupných z Čile boli získané z lokality Consorcio Genomas CoV2 dostupnej na https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Údaje o očkovaní boli získané z verejných údajov Ministerstva vedy, techniky, vedomostí a inovácií dostupných na adrese https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produkt 83).
Test na infekčnosť
Pseudotypizované vírusy nesúce rôzne spike proteíny SARS-CoV-2 boli pripravené tak, ako sme opísali vyššie12. Stručne, pseudotypy SARS-CoV-1 založené na HIV-2 boli produkované v bunkách HEK293T transfekciou pNL4.3-ΔEnv-Luc spolu so zodpovedajúcim vektorom kódujúcim hrot pCDNA-SARS-CoV-2 v molárnom pomere 1:1. Plazmidy kódujúce kodónom optimalizovaný hrot, ktorému chýba posledných 19 aminokyselín C-terminálneho konca (SΔ19), o ktorých je známe, že sa vyhýbajú zadržiavaniu v endoplazmatickom retikule12 boli získané génovou syntézou alebo prispôsobenou miestne cielenou mutagenézou (GeneScript) a obsahovali nasledujúce mutácie: línia A (referenčná sekvencia), línia B (D614G), línia B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), rad P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027, rad T37) 75- 76, L246Q, F252S, D452G, T490N). Každý preparát pseudotypu bol vyčistený centrifugáciou pri 614 859 ot./min pri teplote miestnosti, kvantifikovaný pomocou súpravy HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems), rozdelený na alikvóty v 24 % fetálnom bovinnom sére (Sigma-Aldrich) a skladovaný pri -50 °C do použitie. Na infikovanie buniek HEK-ACE80 sa použili rôzne množstvá pseudotypových vírusov (stanovené hladinami proteínu HIV-1 p24) a o 2 hodín neskôr sa merala aktivita luciferázy svetlušiek pomocou činidla Luciferase Assay Reagent (Promega) na mikroplatni Glomax 48. luminometer (Promega).
Neutralizačný test
Pseudotypové vírusové neutralizačné testy sa uskutočnili v podstate tak, ako sme opísali vyššie12. Stručne, sériové riedenia vzoriek plazmy (1:4 až 1:8748) boli pripravené v DMEM s 10% fetálnym hovädzím sérom a inkubované s 5 ng p24 každého pseudotypového vírusu počas 1 hodiny pri 37 °C a potom 1x104 HEK-ACE2 buniek sa pridalo do každej jamky. Bunky HEK293T (neexprimujúce ACE2) inkubované s pseudotypovým vírusom (línia A) sa použili ako negatívna kontrola. Bunky sa lýzovali o 48 hodín neskôr a aktivita luciferázy svetlušiek sa merala použitím činidla Luciferase Assay Reagent (Promega) v luminometri Glomax 96 Microplate (Promega). Vypočítalo sa percento neutralizácie pre každé riedenie a vypočítalo sa ID50 každej vzorky použitím GraphPad Prism verzia 9.0.1.
Štatistické analýzy
Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru GraphPad Prism verzie 9.1.2. Viacnásobné skupinové porovnania titrov neutralizačných protilátok (NAbT) proti panelu pseudotypovaných vírusov SARS-CoV-2, ako aj porovnania odpovedí NAbs podľa pohlavia a stavu fajčenia sa uskutočnili pomocou spárovaného testu Wilcoxon so znamienkom. Zmena faktora bola vypočítaná ako rozdiel geometrického stredného titra v ID50 v porovnaní s pseudotypovaným vírusom divokého typu. Korelačná analýza medzi NAbT a vekom alebo BMI sa uskutočnila pomocou Spearmanovho testu. Na štatistickú analýzu infekčnosti sa vykonali jednosmerná ANOVA a Tukeyho viacnásobný porovnávací test. Hodnota p ≤ 0.05 sa považovala za štatisticky významnú.
Etické schválenie
Protokol štúdie schválila Etická komisia Lekárskej fakulty Universidad de Chile (projekty č. 0361-2021 a č. 096-2020) a Clinica Santa Maria (projekt č. 132604-21). Všetci darcovia podpísali informovaný súhlas a ich vzorky boli anonymizované.
Vplyv špičkových mutácií vo variante Lambda na infekčnosť a reakcie neutralizujúcich protilátok
Analýza 3695 sekvencií z Čile uložených v GISAID k 24. júnuth Rok 2021 ukazuje jasnú dominanciu variantov SARS-CoV-2 Gamma a Lambda počas posledného trimestra, čo spolu predstavuje 79 % všetkých sekvencií.
Je zaujímavé, že toto obdobie bolo charakterizované masívnou očkovacou kampaňou, v ktorej 65.6 % cieľovej populácie (18-roční a starší jedinci) dostalo kompletnú očkovaciu schému k 27.th 2021
Vzhľadom na to, že 78.2 % ľudí naočkovaných kompletnou schémou dostalo inaktivovanú vírusovú vakcínu CoronaVac od Sinovac Biotech, snažili sme sa preskúmať vplyv vrcholových mutácií prítomných vo variante Lambda na neutralizačnú kapacitu protilátok vyvolaných touto vakcínou.
Na tento účel sme vytvorili pseudotypové vírusy SARS-CoV-1 založené na HIV-2 nesúce spike proteín z referenčnej línie Wuhan-1 (divoký typ; línia A), mutáciu D614G (línia B) a alfa (línia B .1.1.7), varianty Gamma (rod P.1) a Lambda (rod C.37).
Počas prípravy vírusu sme dôsledne pozorovali, že bunky infikované pseudotypovým vírusom nesúcim hrot Lambda produkovali výrazne vyššie hodnoty bioluminiscencie v porovnaní s mutantom D614G alebo variantmi Alfa a Gamma, čo naznačuje zvýšenú infekčnosť poháňanú proteínom hrotu Lambda.
Obrázok 1.Infekčnosť sprostredkovaná rôznymi spike proteínmi.
(A) Schematické znázornenie spike proteínu SARS-CoV-2 a varianty použité v tejto štúdii. Línie sú uvedené v zátvorkách. RBD, receptor-binding domain, CM; cytoplazmatický chvost.
(B) Titrácia pseudotypov každej línie s použitím ekvivalentných množstiev HIV-1 p24. Aktivita luciferázy svetlušiek sa merala ako relatívne luminiscenčné jednotky (RLU) 48 hodín po infekcii. Priemer a SD sa vypočítali z reprezentatívneho trojitého experimentu.
Ďalej sme použili vyššie uvedené pseudotypové vírusy na vykonanie neutralizačných testov s použitím 79 vzoriek plazmy od zdravých zdravotníckych pracovníkov z Universidad de Chile a Clínica Santa María v Santiagu v Čile.
Vylúčili sme 4 vzorky, pretože sme neboli schopní vypočítať titer ID50. Z analyzovaných vzoriek 73 % zodpovedalo ženám, medián veku 34 rokov (IQR 29 – 43) a body max index (BMI) 25 (IQR 22.7 – 27). 20.5 % účastníkov deklarovalo, že sú aktívnymi fajčiarmi počas obdobia imunizácie. Vzorky boli získané v priemere 95 dní (IQR 76 – 96) po druhej dávke vakcíny CoronaVac
Pozorovali sme, že neutralizácia pseudotypového vírusu nesúceho spike proteín divokého typu viedla k 50% inhibičnému riedeniu (ID50) priemerný titer 191.46 (154.9 – 227.95, 95 % CI,), zatiaľ čo bol 153.92 (115.68 – 192.16, 95 % CI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95 – 104.57 % CI), 75.02 % CI), 134.11 % CI ) a 95 (78.75 – 49.8, 107.6 % CI) pre pseudotypové vírusy nesúce spike proteín z mutantu D95G alebo varianty Alfa, Gamma a Lambda.
Tiež sme pozorovali, že geometrický stredný titer ID50 titre sa znížili faktorom 3.05 (2.57 – 3.61, 95 % CI) pre pseudotypový vírus nesúci vrchol lambda, 2.33 (1.95 – 2.80, 95 % CI) pre vrchol gama, 2.03 (1.71 – 2.41 % CI) pre hrot Alpha a 95 (1.37 – 1.20, 1.55 % CI) pre hrot D95G v porovnaní s hrotom typu Wild.
V našej kohorte nebola pozorovaná žiadna korelácia medzi pohlavím, vekom, indexom telesnej hmotnosti (BMI) alebo stavom fajčenia a titrami neutralizačných protilátok.
Obrázok 2.Neutralizačný test s použitím vzoriek plazmy od očkovaných osôb CoronaVac
(A) Zmeny v recipročnom 50% neutralizačnom titri (ID50) vo vzorkách plazmy od 75 príjemcov vakcíny CoronaVac proti D614G (línia B), Alpha (línia B.1.1.7),
Gamma (línia P.1) a Lambda (línia C.37) varianty v porovnaní s vírusom divokého typu. Výsledky sú uvedené ako rozdiel v neutralizačných titroch zodpovedajúcich vzoriek. P hodnoty pre porovnanie ID50 sú vypočítané Wilcoxonovým znamienkovým testom.
(B) Rámcové grafy indikovali stredný a medzikvartilový rozsah (IQR) ID50 pre každý pseudotypový vírus. Zmeny faktorov sú znázornené ako rozdiel geometrického stredného titra v ID50 v porovnaní s tými pre pseudotypovaný vírus divokého typu. Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou Wilcoxonovho testu párov so znamienkom.
Naše údaje spoločne odhalili, že vrcholový proteín novorozpoznaného zaujímavého variantu Lambda, ktorý vo veľkej miere cirkuluje v Čile a krajinách Južnej Ameriky, nesie mutácie spôsobujúce zvýšenú infekčnosť a schopnosť uniknúť z neutralizačných protilátok vyvolaných CoronaVac.
