Time of Death: Nová technológia potrebná pre väčšiu presnosť

Pre výskumníkov, ktorí študujú neurodegeneráciu, tento nedostatok presnej deklarácie „času smrti“ pre neuróny sťažuje určenie toho, aké faktory vedú k bunkovej smrti, a skríning liekov, ktoré by mohli zachrániť starnúce bunky pred umieraním.              

Teraz výskumníci z Gladstone Institutes vyvinuli novú technológiu, ktorá im umožňuje sledovať tisíce buniek naraz a určiť presný okamih smrti ktorejkoľvek bunky v skupine. Tím ukázal v článku publikovanom v časopise Nature Communications, že tento prístup funguje v bunkách hlodavcov a ľudí, ako aj v živých zebrách, a možno ho použiť na sledovanie buniek počas niekoľkých týždňov až mesiacov.

„Získanie presného času smrti je veľmi dôležité pre odhalenie príčiny a následku neurodegeneratívnych chorôb,“ hovorí Steve Finkbeiner, MD, PhD, riaditeľ Centra pre systémy a terapeutiku v Gladstone a hlavný autor oboch nových štúdií. "Umožňuje nám to zistiť, ktoré faktory priamo spôsobujú bunkovú smrť, ktoré sú náhodné a ktoré môžu byť mechanizmami zvládania, ktoré odďaľujú smrť."

V sprievodnom článku publikovanom v časopise Science Advances výskumníci skombinovali technológiu bunkových senzorov s prístupom strojového učenia a naučili počítač, ako rozlíšiť živé a mŕtve bunky 100-krát rýchlejšie a presnejšie ako človek.

„Vysokoškolákom trvalo niekoľko mesiacov, kým ručne analyzovali tento druh údajov, a náš nový systém je takmer okamžitý – v skutočnosti beží rýchlejšie, než dokážeme získať nové snímky na mikroskope,“ hovorí Jeremy Linsley, PhD, vedúci vedeckého programu v spoločnosti Finkbeiner's. laboratória a prvým autorom oboch nových článkov.

Naučte starý senzor nové triky

Keď bunky odumierajú – bez ohľadu na príčinu alebo mechanizmus – nakoniec sa fragmentujú a ich membrány degenerujú. Ale tento proces degradácie si vyžaduje čas, takže je pre vedcov ťažké rozlíšiť medzi bunkami, ktoré už dávno prestali fungovať, tými, ktoré sú choré a umierajú, a tými, ktoré sú zdravé.

Výskumníci zvyčajne používajú fluorescenčné značky alebo farbivá na sledovanie chorých buniek mikroskopom v priebehu času a snažia sa diagnostikovať, kde sa nachádzajú v rámci tohto degradačného procesu. Mnoho indikátorových farbív, škvŕn a štítkov bolo vyvinutých na odlíšenie už mŕtvych buniek od tých, ktoré sú stále nažive, ale často fungujú len počas krátkych časových úsekov pred vyblednutím a môžu byť tiež toxické pre bunky, keď sa aplikujú.

„Naozaj sme chceli indikátor, ktorý vydrží celý život bunky – nielen niekoľko hodín – a potom dá jasný signál až po konkrétnom okamihu, keď bunka zomrie,“ hovorí Linsley.

Linsley, Finkbeiner a ich kolegovia kooptovali vápnikové senzory, pôvodne navrhnuté na sledovanie hladín vápnika v bunke. Keď bunka odumiera a jej membrány sa stávajú netesnými, jedným z vedľajších účinkov je, že vápnik sa ponáhľa do bunkového vodnatého cytosolu, ktorý má normálne relatívne nízke hladiny vápnika.

Linsley teda skonštruoval vápnikové senzory tak, aby sa nachádzali v cytosóle, kde by fluoreskovali iba vtedy, keď sa hladina vápnika zvýšila na úroveň, ktorá naznačuje smrť buniek. Nové senzory, známe ako geneticky kódovaný indikátor smrti (GEDI, vyslovované ako Jedi v Hviezdnych vojnách), by mohli byť vložené do akéhokoľvek typu bunky a signalizovať, že bunka je živá alebo mŕtva počas celého života bunky.

Aby sa otestovala užitočnosť prepracovaných senzorov, skupina umiestnila pod mikroskop veľké skupiny neurónov, z ktorých každý obsahoval GEDI. Po vizualizácii viac ako milióna buniek, v niektorých prípadoch náchylných na neurodegeneráciu a v iných vystavených toxickým zlúčeninám, výskumníci zistili, že senzor GEDI bol oveľa presnejší ako iné indikátory bunkovej smrti: nebol jediný prípad, kedy by bol senzor aktivovaný a bunka zostala nažive. Okrem tejto presnosti sa tiež zdalo, že GEDI deteguje bunkovú smrť v skoršom štádiu ako predchádzajúce metódy - blízko „bodu, z ktorého niet návratu“ pre bunkovú smrť.

"To vám umožňuje oddeliť živé a mŕtve bunky spôsobom, ktorý nikdy predtým nebol možný," hovorí Linsley.

Detekcia nadľudskej smrti

Linsley spomenul GEDI svojmu bratovi – Drewovi Linsleymu, PhD, docentovi na Brown University, ktorý sa špecializuje na aplikáciu umelej inteligencie na rozsiahle biologické údaje. Jeho brat navrhol, aby vedci použili senzor v spojení s prístupom strojového učenia, aby naučili počítačový systém rozpoznávať živé a mŕtve mozgové bunky len na základe tvaru bunky.

Tím spojil výsledky z nového senzora so štandardnými fluorescenčnými údajmi na rovnakých neurónoch a naučil počítačový model nazývaný BO-CNN, aby rozpoznal typické fluorescenčné vzorce spojené s tým, ako vyzerajú umierajúce bunky. Bratia Linsleyovci ukázali, že model bol na 96 percent presný a lepší ako to, čo dokážu ľudskí pozorovatelia, a bol viac ako 100-krát rýchlejší ako predchádzajúce metódy rozlišovania živých a mŕtvych buniek.

„Pri niektorých typoch buniek je pre človeka mimoriadne ťažké zistiť, či je bunka živá alebo mŕtva – ale náš počítačový model, keď sa naučil z GEDI, ich dokázal rozlíšiť na základe častí obrázkov, ktoré sme predtým nepoznali. boli nápomocné pri rozlišovaní živých a mŕtvych buniek,“ hovorí Jeremy Linsley.

GEDI aj BO-CNN teraz umožnia výskumníkom vykonávať nové, vysoko výkonné štúdie, aby zistili, kedy a kde mozgové bunky umierajú – čo je veľmi dôležitý koncový bod pre niektoré z najdôležitejších chorôb. Môžu tiež skrínovať lieky na ich schopnosť oddialiť alebo vyhnúť sa bunkovej smrti pri neurodegeneratívnych ochoreniach. Alebo v prípade rakoviny môžu hľadať lieky, ktoré urýchľujú odumieranie chorých buniek.

„Tieto technológie menia hru v našej schopnosti pochopiť, kde, kedy a prečo dochádza k smrti v bunkách,“ hovorí Finkbeiner. „Po prvýkrát môžeme skutočne využiť rýchlosť a rozsah, ktorý poskytuje pokrok v robotizovanej mikroskopii, na presnejšiu detekciu bunkovej smrti, a to v dostatočnom predstihu pred okamihom smrti. Dúfame, že to môže viesť k špecifickejším terapeutikám pre mnohé neurodegeneratívne ochorenia, ktoré boli doteraz nevyliečiteľné.“